2.2 VhPLD對不同磷脂單分子層的吸附動力學參數(shù)

單分子層最適合用來模擬細胞膜結(jié)構(gòu)，基于此模型不僅可以研究界面酶分解脂質(zhì)的動力學，還可以通過跟蹤脂質(zhì)分子面積的變化來研究蛋白質(zhì)在磷脂單分子層上的吸附動力學，其中脂質(zhì)分子面積的變化直接由界面表面壓力的增加值(ΔΠ)進行精確監(jiān)測[11-12]。磷脂分子是兩親性結(jié)構(gòu)，由疏水性的酰基鏈尾端和一個極性頭所組成。當含有磷脂的氯仿溶液滴加到水相表面時，隨著氯仿有機溶劑的揮發(fā)，磷脂分子自然鋪展開來，隨即形成磷脂單分子層膜。單分子層技術(shù)正是基于該原理進行單分子層的制備，同時，利用高靈敏度探針精確測量磷脂單分子層的表面壓力變化。選取常見的幾種磷脂(PC、PE、PS、PG和PI)，測量VhPLD對不同磷脂的吸附動力學參數(shù)。同時，嘗試比較不同初始表面壓力條件下，酶蛋白吸附動力學參數(shù)的變化。對于不同的磷脂單分子層，選定的蛋白濃度范圍為10～250 nmol/L，在不同的Πi下進行一系列的吸附動力學測定。

2.2.1單一初始表面壓力條件下VhPLD對不同磷脂單分子層膜的吸附動力學參數(shù)

由于膜組分通常形成水不溶性單分子層，因此膜表面濃度被定義為單位面積上界面的物質(zhì)量。膜表面壓力π被定義為水相表面張力(γ0)與薄膜覆蓋表面的表面張力(γf)之差，其中γ0為72.8 mN/m[13]。表面壓力是表征磷脂單分子層的一個重要的參數(shù)。Boisselier等[14]提出影響蛋白與脂質(zhì)單分子層結(jié)合的因素有很多，如下相中緩沖液的組成、脂質(zhì)膜的性質(zhì)、蛋白的性質(zhì)等。

在初始表面壓力為15 mN/m的條件下(見圖2)，VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附常數(shù)分別為(1.19±0.02)×104、(6.69±0.55)×103、(8.51±0.93)×103、(3.59±0.17)×103、(2.89±0.35)×103mol/(L·s)。VhPLD對不同磷脂單分子層膜的吸附常數(shù)之間存在顯著性差異(P<0.05)，其中，吸附常數(shù)最大值出現(xiàn)在PC，最小值出現(xiàn)在PI。吸附常數(shù)值越大，表明酶蛋白越容易吸附到磷脂質(zhì)-水界面上。VhPLD對PC、PE、PS的解離常數(shù)分別為(2.99±0.20)×10-3、(3.67±0.50)×10-3、(3.82±0.81)×10-3s-1，統(tǒng)計學分析表明3組數(shù)據(jù)之間無顯著性差異(P>0.05)。而VhPLD對于PG和PI的解離常數(shù)分別為(1.17±0.24)×10-3s-1和(1.77±0.48)×10-3s-1，統(tǒng)計學分析表明2組數(shù)據(jù)之間無顯著性差異(P>0.05)。然而，VhPLD對PC、PE和PS的解離常數(shù)與對PG和PI的解離常數(shù)之間存在顯著性差異(P<0.05)。解離常數(shù)越小，表明酶蛋白與磷脂結(jié)合越緊密，不容易從界面上解離下來，反之，表明酶蛋白越容易與磷脂分離。在初始表面壓力15 mN/m條件下，該酶對PC具有最大的吸附平衡常數(shù)((3.98±0.01)×106mol/L)，其次是PG((3.07±0.15)×106mol/L)，相反地，對于PE和PI的吸附平衡常數(shù)僅為(1.82±0.15)×106mol/L和(1.63±0.20)×106mol/L。吸附平衡常數(shù)反映的是酶對磷脂的親和力(或者是偏好性)大小，吸附平衡常數(shù)值越大，表明酶對磷脂的親和力越大，反之，親和力越小。以上結(jié)果表明，在初始表面壓力為15 mN/m的條件下，VhPLD對PC的親和力最強，而對于PE和PI的親和力最弱。在初始表面壓力15 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為PC>PG>PS>PE=PI。

圖2初始表面壓力15 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數(shù)

在初始表面壓力為20 mN/m條件下(見圖3)，與VhPLD在初始表面壓力為15 mN/m條件下對不同磷脂的吸附常數(shù)趨勢相同，VhPLD對PC的吸附常數(shù)最大((1.57±0.19)×104mol/(L·s))，其次為PS((1.26±0.10)×104mol/(L·s))。VhPLD對PG和PI的ka值分別為(3.72±0.12)×103mol/(L·s)和(3.49±0.35)×103mol/(L·s)，均顯著低于其他磷脂底物。然而，在20 mN/m條件下，VhPLD對于PE的解離常數(shù)((8.48±1.31)×10-3s-1)明顯高于PC((3.80±1.40)×10-3s-1)和PS((4.26±0.97)×10-3s-1)，該結(jié)果與在15 mN/m條件下結(jié)果有較大差異。VhPLD對于PG和PI的吸附平衡常數(shù)分別為(5.43±0.02)×106mol/L和(5.12±0.05)×106mol/L。該結(jié)果表明在初始表面壓力20 mN/m條件下，酶對PG的親和力最大，其次為PI，而對于PE的親和力最小，吸附偏好性順序依次為PG>PI>PC>PS>PE。

在初始表面壓力為25 mN/m的條件下(見圖4)，VhPLD對PC的吸附常數(shù)最大((1.46±0.10)×104mol/(L·s))，對于PG((3.58±0.31)×103mol/(L·s))和PI((4.30±0.34)×103mol/(L·s))的吸附常數(shù)最小。在該初始表面壓力條件下，VhPLD對于PC、PE和PS的解離常數(shù)之間不存在顯著差異(P>0.05)，該結(jié)果與在15 mN/m所測定的結(jié)果保持一致。而在該條件下獲得的VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為PC>PS>PI>PE=PG。

圖3初始表面壓力為20 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數(shù)

圖4初始表面壓力為25 mN/m的條件下VhPLD對PC、PE、PS、PG和PI的吸附動力學參數(shù)

2.2.2不同初始表面壓力條件下VhPLD對單一磷脂的吸附動力學參數(shù)比較

相比于15 mN/m的初始表面壓力條件，VhPLD在20 mN/m和25 mN/m條件下對PC、PE和PS的吸附常數(shù)均顯著高于15 mN/m條件下相應的ka值(P<0.05)，VhPLD在20 mN/m和25 mN/m條件下ka之間卻沒有顯著性差異(P>0.05)。而對于PG而言，不同初始表面壓力條件下ka之間沒有顯著性差異(P>0.05)。相反的，VhPLD在25 mN/m條件下PI的ka與在15 mN/m和20 mN/m條件下均有顯著性差異(P<0.05)。

對于解離常數(shù)，除了在20 mN/m條件下對PE的kd值顯著高于15 mN/m和25 mN/m條件下外，其他磷脂底物在不同初始表面壓力下的kd值之間均沒有顯著性差異(P>0.05)。

不同初始表面壓力條件對VhPLD的磷脂吸附親和力具有較大的影響。對于PC及PS而言，親和力隨著表面壓力的增加而逐漸增大，對于PE來說，其在20 mN/m條件下的親和力要顯著低于其他表面壓力條件下的值，主要原因是由于在此表面壓力條件下的kd值變大引起的。而對于PG和PI，最大的親和力出現(xiàn)在20 mN/m條件下，主要是由于在此條件下酶的解離常數(shù)降低所導致。

3、結(jié)論

酶蛋白對于磷脂質(zhì)-水界面的吸附動力學參數(shù)與磷脂單分子層的種類及不同初始表面壓力狀態(tài)密切相關(guān)。在15 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為磷脂酰膽堿>磷脂酰甘油>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰乙醇胺=磷脂酰肌醇；在20 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序為磷脂酰甘油>磷脂酰肌醇>磷脂酰膽堿>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰乙醇胺；而在25 mN/m條件下，VhPLD對不同磷脂單分子層吸附偏好性順序則轉(zhuǎn)變?yōu)榱字Ｄ憠A>磷脂酰絲氨酸>磷脂酰肌醇>磷脂酰乙醇胺=磷脂酰甘油。該結(jié)果提示在表征酶對不同磷脂吸附動力學參數(shù)的時候，必須要強調(diào)所處的表面壓力條件，否則單純評價對于不同磷脂的吸附動力學參數(shù)是沒有意義的。

LB膜分析儀應用：不同初始表面壓力條件對VhPLD的磷脂吸附親和力影響（一）

LB膜分析儀應用：不同初始表面壓力條件對VhPLD的磷脂吸附親和力影響（二）